Bir Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) reaksiyonunun bileşenlerinin herhangi birine yapılan ayarlamalar, ya ürünün verimini ve kalitesini iyileştirerek ya da azaltarak ya da reaksiyon spesifitesini ve duyarlılığını geliştirerek, sonucun kalitesini değiştirebilir. Son sonucu etkileyen parametreler, fiziksel (yani sıcaklık, döngü süreleri) veya kimyasal (yani, şablon konsantrasyonu, kullanılan enzim tipi) olabilir. Aşağıdakiler, PCR'nin başarısını etkileyen birkaç temel faktördür.
01 Temiz Laboratuvar Koşulları
PCR , tek bir DNA molekülünü tespit edebildiğinden, laboratuvarda bozulmamış koşulların sürdürülmesi önemlidir. Her zaman yeni eldivenler giyin, steril cam malzemeler, tüpler ve pipet uçları ve steril solüsyonlar kullanın ve işe başlamadan önce çalışma alanını temizleyin.
Sonuçların doğru numunenin amplifikasyonu nedeniyle gerçekten olduğundan emin olmak için her zaman şablon DNA'sız ve enzimsiz kontrol reaksiyonları içerir.
Çoğu insan, sorun giderme işlemini kolaylaştırmak için paylaşılmayan kendi çözüm setlerine sahip olduğundan emin olur ve belirlenen pipetler genellikle yalnızca PCR için ayrılır. DNaz ve RNaz içermeyen PCR tüpleri, aerosol dirençli pipet uçları ve UV ışığına sahip davlumbazlarda çalışmak da problemleri en aza indirmenin yollarıdır.
02 Kimyasal Bileşenler
- 18 ila 24 üs
- İkincil bir yapıya sahip olmamalıdır (ör. Firkete halkaları)
- G / C ve A / T çiftlerinin dengeli dağılımı var
- 3-ayak uçlarında birbirini tamamlayıcı değil
- Genellikle 55 ve 65 derece Celcius arasında olan tavlama sıcaklığının altında 5-10 derece Celcius erime sıcaklıkları (Tm) var
Her iki primerler için Tm de en iyi sonuçlar için benzer olmalıdır.
03 Reaksiyon Karışımı: Şablon ve Astarlar
Optimal primer konsantrasyonları 0.1 ila 0.6 mikromol / L arasındadır. Şablon miktarı, DNA'nın türüne (insan, bakteri, plazmid) bağlı olarak değişir.
Çok az miktarda şablonla, artan döngü sayıları veya "sıcak başlangıç" kullanımı gibi sonuçları iyileştirmek için başka stratejiler de vardır. Her zaman belirli deney koşullarınız altında çalıştıklarından emin olmak için yeni primerler pozitif kontrol reaksiyonu ile test edin.
04 Reaksiyon Karışımı: Enzim Aktivitesi
Reaksiyon karışımındaki MgCl2 konsantrasyonu, PCR sonucunu etkileyebilir ve daha titiz reaksiyonlarda önemli bir rol oynayabilir. Magnezyum katyonu, polimeraz enziminin tanıdığı gerçek substratı üretmek için dNTP'ler ile çözünebilir kompleksler oluşturur.
Dört dNTP'nin eşit miktarları da polimeraz hata oranını azaltmaya yardımcı olur. Betain, BSA, deterjanlar, DMSO, gliserol ve pirofosfataz gibi belirli katkı maddeleri de enzim spesifitesini veya reaksiyon verimliliğini etkileyebilir.
05 Tipi Thermocycler
Laboratuar ekipmanı için alışveriş yaparken, bazı termosellerin, istenen sıcaklıkların korunmasında diğerlerine göre daha az hassas olduklarını unutmayın.
Bu, ince bir reaksiyonla karşılaştığınızda veya dar bir tavlama sıcaklığı aralığı gerektiren primerler kullanarak uzun vadede ucuza gitmeyecek bir alan.
Kullandığınız termosikerin kesin markasına uyacak şekilde tasarlanmış ince duvarlı reaksiyon tüpleri, aynı zamanda reaksiyon sıcaklıklarının optimize edilmesine yardımcı olur.
06 Döngü Ayarları
Artan randıman, daha fazla şablonu daha az büyütmek için daha az enzimi telafi etmek için, her 20 döngüdeki uzatma süresini artırarak elde edilebilir. Genellikle, 40'dan az döngü, 10'dan az şablon molekülünü, bir etidyum bromür ile lekelenmiş agaroz jeli üzerinde görüntülenecek kadar büyük bir konsantrasyona yükseltmek için yeterlidir.