1983'te geliştirilen, PCR süreci, DNA dizilemesini gerçekleştirmeyi ve tek tek genlerdeki nükleotidlerin sırasını belirlemeyi mümkün kılmıştır.
Metot, termal çevrim veya DNA eritme ve replikasyonu için reaksiyonun tekrarlı ısıtılması ve soğutulmasını kullanır. PCR devam ettikçe, replika için bir şablon olarak “yeni” DNA kullanılır ve DNA şablonunu üssel olarak artıran bir zincir reaksiyonu ortaya çıkar.
Protein mühendisliği , klonlama, adli tıp (DNA parmak izi), babalık testi, kalıtsal ve / veya enfeksiyöz hastalıkların teşhisi ve çevresel örneklerin analizi dahil olmak üzere birçok biyoteknoloji alanında PCR teknikleri uygulanmaktadır.
Adli tıpta özellikle PCR özellikle yararlıdır, çünkü en küçük DNA kanıt miktarını bile arttırır. PCR ayrıca binlerce yaşında olan DNA'yı analiz etmek için de kullanılabilir ve bu teknikler 800.000 yıllık bir mamuttan dünyanın her yerinden mumyalara kadar her şeyi tanımlamak için kullanılmıştır.
PCR prosedürü aşağıdaki gibidir:
- Başlangıç: Bu adım sadece sıcak başlangıçlı PCR gerektiren DNA polimerazları için gereklidir. Reaksiyon 94 ila 96 ° C arasında ısıtıldı ve 1-9 dakika tutuldu.
- Denatürasyon: Eğer prosedür başlatmayı gerektirmiyorsa, denatürasyon ilk adımdır. Reaksiyon 20-30 saniye 94-98 ° C'ye ısıtıldı. DNA şablonunun hidrojen bağları bozulur ve tek iplikli DNA molekülleri oluşturulur.
- Tavlama: Reaksiyon sıcaklığı 50 ila 65 ° C'ye düşer ve 20-40 saniye tutulur. Primerler, tek iplikli DNA şablonuna bağlanır. Bu aşamada sıcaklık çok önemlidir. Çok sıcaksa, astar bağlayıcı olmayabilir. Çok soğuk ise, astar kusurlu bir şekilde bağlanabilir. Primer sekansı şablon sekansı ile çok yakın olduğunda iyi bir bağ oluşur.
- Uzatma / Uzama: Bu adımdaki sıcaklık polimeraz tipine bağlı olarak değişir. DNA polimeraz tamamen yeni bir DNA ipliği sentezler.
- Son uzama: Bu adım, son PCR döngüsünden 5-15 dakika sonra 70-74 ° C'de gerçekleştirilir.
- Son bekletme: Bu adım isteğe bağlıdır. Sıcaklık 4-15 ° C'de tutulur ve reaksiyonu keser.
Prosedür üç aşamaya ayrılmıştır:
- Üstel büyütme: Her döngüde ürün (çoğaltılan özel DNA parçası) ikiye katlanır.
- Düzleme aşaması: DNA polimeraz aktivitesini kaybederken ve reaktifleri tüketirken, reaksiyon yavaşlar.
- Yayla: Artık ürün birikmez.