Gerekli olan protein saflığının derecesi, proteinin amaçlanan son kullanımına bağlıdır.
Bazı uygulamalar için ham bir özüt yeterlidir. Bununla birlikte, gıda ve farmasötik ürünler gibi diğer kullanımlar için yüksek düzeyde bir saflık gerekmektedir. Bu birkaç protein arıtma yöntemine ulaşmak için tipik olarak bir dizi saflaştırma adımında kullanılır.
Her bir protein saflaştırma aşaması genellikle bir dereceye kadar ürün kaybına yol açar. Bu nedenle ideal bir protein arıtma stratejisi, en yüksek seviyede arıtma seviyesine en az adımda ulaşılır. Kullanılacak adımların seçimi, hedef proteinin büyüklüğü, yükü, çözünürlüğü ve diğer özelliklerine bağlıdır. Aşağıdaki teknikler, tek bir sitosolik proteinin saflaştırılması için en uygun olanlardır. Sitosolik protein komplekslerinin saflaştırılması daha karmaşıktır ve genellikle farklı yöntemlerin uygulanmasını gerektirir.
Protein Saflaştırma için İlk Adımlar
Hücre içi ( hücre içinde) proteinlerin saflaştırılmasındaki ilk adım, ham bir ekstraktın hazırlanmasıdır.
Ekstrakt, hücre sitoplazmasından tüm proteinlerin ve bazı ek makromoleküller, kofaktörler ve besleyicilerin kompleks bir karışımını içerecektir. Ham ekstrat, biyoteknolojideki bazı uygulamalar için kullanılabilir, ancak saflık bir sorunsa, sonraki saflaştırma adımları takip edilmelidir.
Ham protein ekstraktları, kimyasallar ve enzimler , sonikasyon veya bir Fransız Pres kullanılarak elde edilen hücre parçalanmasıyla üretilen hücresel kalıntıların uzaklaştırılmasıyla hazırlanır. Enkaz santrifüj ile çıkarılır ve süpernatan geri kazanılır. Hücre dışı proteinlerin ham preparatları, hücreleri santrifüj yoluyla basitçe çıkararak elde edilebilir.
Bazı biyoteknoloji uygulamaları için, termostabil enzimler için bir talep vardır: Denatüre edilmeden yüksek sıcaklıklara dayanabilen ve yüksek bir spesifik aktiviteyi koruyan enzimler . Onları üreten organizmalara bazen ekstremofiller denir. Isıya dirençli bir proteinin saflaştırılması için kolay bir yaklaşım, karışımdaki diğer proteinleri ısıtmak, daha sonra çözeltiyi soğutmak (böylece termostabil enzimin gerektiğinde yeniden şekillendirilmesine veya yeniden çözülmesine izin vermek) denatüre proteinlerin daha sonra santrifüjleme yoluyla uzaklaştırılmasıdır.
Orta Saflaştırma Basamakları
Geçmişte, bir ham ekstrakttan bir proteinin saflaştırılması için yaygın bir ikinci aşama, yüksek ozmotik mukavemete (yani, tuz çözeltilerine) sahip bir çözelti içinde çökeltme ile olmuştur. Ham ekstrakttaki nükleik asitler, streptomisin sülfat veya protamin sülfat ile oluşturulan çökeltilerle giderilebilir.
Protein çökeltmesi genellikle tuz olarak amonyum sülfat kullanılarak yapılır.
Farklı proteinler, farklı amonyum sülfat konsantrasyonlarında çökelir. Genel olarak, daha yüksek moleküler ağırlıklı proteinler, daha düşük amonyum sülfat konsantrasyonlarında çökeltiler. Tuz çökeltmesi genellikle yüksek oranda saflaştırılmış bir proteine yol açmaz, ancak bir karışımdaki istenmeyen proteinlerin elimine edilmesine ve numunenin konsantre edilmesine yardımcı olabilir. Çözelti içindeki tuzlar daha sonra gözenekli selüloz tüpü, filtrasyon veya jel eksklüzyon kromatografisi yoluyla diyaliz yoluyla uzaklaştırılır.
Modern biyoteknoloji protokolleri genellikle standart prosedürler için hazır çözümler sunan piyasada satılan birçok kitin avantajlarından yararlanır. Protein saflaştırması genellikle filtreler ve hazırlanan jel filtrasyon sütunları kullanılarak gerçekleştirilir. Tek yapmanız gereken talimatları takip etmek ve doğru çözümün doğru hacmini eklemek ve yeni bir test tüpünde elüent (sütunun diğer ucunu ortaya çıkaran) toplarken belirlenen süre kadar beklemek.
- Kromatografik yöntemler, tezgah üstü kolonlar veya otomatik HPLC ekipmanı kullanılarak uygulanabilir. HPLC ile ayırma, ters faz, iyon değişimi veya boyut dışlama yöntemleri ve diyot dizisi veya lazer teknolojisi ile tespit edilen örnekler ile yapılabilir.
Protein Görselleştirme ve Saflaştırmanın Değerlendirilmesi
- Ters fazlı kromatografi (RPC), proteinleri nispi hidrofobikliklerine göre ayırır. Bu teknik oldukça seçicidir fakat organik çözücülerin kullanılmasını gerektirir. Bazı proteinler çözücüler tarafından kalıcı olarak denatüre edilir ve RPC sırasında işlevselliğini kaybeder. Bu nedenle, özellikle hedef proteinin aktiviteyi sürdürmesi için gerekliyse, bu yöntem tüm uygulamalar için önerilmez.
- İyon değişim kromatografisi , yüklere dayanan proteinlerin ayrılmasını ifade eder. Kolonlar, anyon değişimi veya katyon değişimi için hazırlanabilir. Anyon değişim kolonları, negatif yüklü proteinleri çeken pozitif bir yüke sahip sabit bir faz içerir. Katyon değişim kolonları, pozitif yüklü proteinleri çeken ters, negatif yüklü boncuklardır. Hedef protein (ler) in elüsyonu, kolondaki pH değiĢtirilerek yapılır, bu da her proteinin yüklü fonksiyonel gruplarının bir değiĢiklik veya nötralizasyonu ile sonuçlanır.
- Boyut dışlama kromatografisi ( jel filtrasyonu ), daha büyük moleküller, kromatografi kolonundaki çapraz bağlı polimerden daha hızlı gittiği için daha büyük proteinleri küçüklerden ayırır. Büyük proteinler, polimerin gözeneklerine uymazken, daha küçük proteinler, daha az doğrudan rotası yoluyla, kromatografi kolonundan geçerek daha uzun sürebilirler. Eluat, elüsyon süresine dayalı olarak proteinleri ayıran bir dizi tüpte toplanır. Jel filtrasyonu, bir protein numunesinin konsantrasyonu için yararlı bir araçtır çünkü hedef protein, sütuna ilk olarak eklenmiş olandan daha küçük bir elüsyon hacminde toplanır. Benzer filtrasyon teknikleri, büyük ölçekli protein üretimi sırasında maliyet etkinliği nedeniyle kullanılabilir.
- Afinite kromatografisi , "parlatma" veya protein saflaştırma işleminin tamamlanması için çok kullanışlı bir tekniktir. Kromatografi kolonundaki boncuklar, spesifik olarak hedef proteine bağlanan ligandlara çapraz bağlanır. Protein daha sonra serbest ligandlar içeren bir çözelti ile durulayarak kolondan çıkarılır. Bu yöntem, diğer tekniklere kıyasla en saf sonuçları ve en yüksek spesifik aktiviteyi verir.
- SDS-PAGE , büyük bir net negatif yük veren proteinlere bağlanan SDS (sodyum dodesil sülfat) varlığında gerçekleştirilen poliakrilamid jel elektroforezidir. Tüm proteinlerin ücretleri oldukça eşit olduğu için, bu yöntem onları neredeyse tamamen büyüklüğüne göre ayırır. SDS-PAGE genellikle bir serideki her adımdan sonra proteinin saflığını test etmek için kullanılır. İstenmeyen proteinler yavaş yavaş karışımdan uzaklaştırıldığı için, SDS-PAGE jeli üzerinde görüntülenen bant sayısı, istenen proteini temsil eden sadece bir bant bulunana kadar azaltılır.
- Immunoblotting , afinite kromatografisi ile kombinasyon halinde uygulanan bir protein görselleştirme tekniğidir. Belirli bir protein için antikorlar, bir afinite kromatografi kolonu üzerinde ligandlar olarak kullanılır. Hedef protein kolon üzerinde tutulur, daha sonra sütunu bir tuz çözeltisi veya başka maddelerle durulayarak çıkarılır. Radyoaktif veya boya etiketlerine bağlı antikorlar, karışımın geri kalanından ayrıldıktan sonra hedef proteinin tespit edilmesine yardımcı olur.
Kaynaklar:
Zubay G. 1988. Biyokimya, 2. Baskı. Macmillan Publishing Co., New York, NY, ABD.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protein Saflaştırma El Kitabı, Baskı AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, Amerika Birleşik Devletleri. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.