Gen klonlaması, tek bir genin kopyalarını veya klonlarını yapma eylemidir. Bir gen tanımlandığında, klonlar biyomedikal ve endüstriyel araştırmaların birçok alanında kullanılabilir. Genetik mühendisliği, genleri yeni organizmalara klonlama veya protein ürününü değiştirmek için DNA dizisini değiştirme işlemidir. Genetik mühendisliği aşağıdaki temel prosedürleri yerine getirme yeteneğimize bağlıdır.
01 Polimeraz Zincir Reaksiyonu
02 Kısıtlama Enzimleri
Kısıtlama endonükleazları olarak bilinen enzimlerin keşfi, protein mühendisliği için gerekli olmuştur. Bu enzimler, nükleotid dizisine dayanarak belirli yerlerde DNA'yı kesti. Farklı bir bölgede DNA'yı kesebilen yüzlerce farklı kısıtlama enzimi , birçok farklı bakteri türünden izole edilmiştir. Bir kısıtlama enzimi ile kesilen DNA, değişen boyutlarda çok daha küçük parçalar üretir. Bunlar jel elektroforezi veya kromatografi kullanılarak ayrılabilir.
03 Elektroforez
DNA'yı bir hücre kültüründen saflaştırmak ya da kısıtlama enzimleri kullanarak kesmek, DNA'yı görselleştiremediğimizde çok fazla kullanılmayacaktır - yani, özünüzün herhangi bir şey içerip içermediğini ya da ne boyutta parçalara sahip olduğunu görmenin bir yolunu bulursunuz. onu kestim. Bunu yapmanın bir yolu jel elektroforezidir. Jeller, kesilmiş DNA'yı DNA insertlerini ve knockout'ları tespit etmek için çeşitli amaçlarla kullanılır.
04 İki Adet DNA'ya Katılın
Genetik araştırmalarda, rekombinant bir iplik oluşturmak veya kısıtlama enzimleri ile kesilmiş dairesel bir ipliği kapatmak için DNA'nın iki veya daha fazla tek tek telini bağlamak gereklidir. DNA ligazları olarak adlandırılan enzimler, nükleotit zincirleri arasında kovalent bağlar oluşturabilir. Enzimler DNA polimeraz I ve polinükleotid kinaz da bu işlemde boşlukları doldurmak veya 5 'uçlarını fosforlamak için önemlidir.
05 Küçük Kendinden Çoğaltılan DNA Seçimi
Bakteriyel bir genomun parçası olmayan, ancak kendi kendini kopyalayabilen küçük yuvarlak DNA parçaları, plazmid olarak bilinir. Plazmidler genellikle mikroorganizmalar arasındaki genleri taşımak için vektörler olarak kullanılır. Biyoteknolojide, ilgilenilen gen amplifiye edildiğinde ve hem gen hem de plazmid kısıtlama enzimleri tarafından kesildikten sonra, rekombinant DNA olarak bilinen bir şeyin üretilmesiyle birlikte bağlanırlar. Viral (bakteriyofaj) DNA, kozmidler, bakteriyofaj genleri içeren rekombinant plazmidler gibi bir vektör olarak da kullanılabilir.
Bir vektör hücresine bir vektör taşımak için bir yöntem
Genetik materyali plazmid gibi bir vektör üzerinde yeni konakçı hücrelere transfer etme işlemine dönüşüm denir. Bu teknik, konakçı hücrelerin, onları "yetkin" hale getiren veya vektöre geçici olarak geçirgen bir çevresel değişikliğe maruz kalmasını gerektirir. Elektroporasyon böyle bir tekniktir. Plazmid ne kadar büyükse, hücreler tarafından alındığı etkinlik o kadar düşük olur. Daha büyük DNA segmentleri, transdüksiyon olarak adlandırılan bir yöntemde bakteriyofaj, retrovirüs veya diğer viral vektörler veya kozmidler kullanılarak daha kolay klonlanır. Rejeneratif tıbbında sıklıkla faj veya viral vektörler kullanılır, fakat bizim istemediğimiz kromozomlarımızın bazı kısımlarında DNA'nın sokulmasına neden olarak komplikasyonlara ve hatta kansere neden olabilir.
07 Transgenik Organizmaları Seçme Yöntemleri
Dönüşüm sırasında tüm hücreler DNA'yı almayacaktır. Olanları tespit etmek için bir yöntem olması şarttır. Genellikle, plazmidler antibiyotik direnci için genler taşırlar ve bu genlerin ekspresyonuna ve bu antibiyotiği içeren ortamlarda büyüme yeteneklerine dayanarak transgenik hücreler seçilebilir. Alternatif seçim yöntemleri, sırasıyla x-gal / lacZ sistemi veya renk ve flüoresan bazında seçim yapılmasına izin veren yeşil floresan proteini gibi diğer raportör proteinlerin varlığına bağlıdır.