DNA'nın DNA Sıralama ve Genlerin Güçlendirilmesi ile Yapması Gerekenler
Polimeraz zincir reaksiyonu ( PCR ), bir genin çoklu kopyalarını yapmak için bir moleküler genetik tekniktir ve aynı zamanda gen dizileme işleminin bir parçasıdır.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu Nasıl Çalışır?
Gen kopyaları, bir DNA örneği kullanılarak yapılır ve teknoloji, örnekte bulunan genin tek bir kopyasından çoklu kopyalar yapmak için yeterince iyidir. Milyonlarca kopya yapmak için bir genin PCR amplifikasyonu, DNA parçasının büyüklüğüne ve yüküne (+ veya -) dayalı görsel teknikler kullanılarak gen dizilerinin saptanmasına ve tanımlanmasına izin verir.
Kontrollü koşullar altında, DNA polimerazları olarak bilinen enzimlerle küçük DNA parçaları üretilir, bu da "şablon" olarak bilinen bir DNA parçasına ücretsiz deoksinükleotitler (dNTP'ler) ekler. "Primerler" olarak adlandırılan daha küçük DNA parçaları bile polimeraz için bir başlangıç noktası olarak kullanılır. Primerler, genellikle 15 ila 30 nükleotit uzunluğunda, insan yapımı küçük DNA parçalarıdır (oligomerler). Büyütülen genin çok uçlarında kısa DNA dizileri bilinerek veya tahmin edilerek yapılır. PCR sırasında, sıralanan DNA ısıtılır ve çift teller ayrılır. Soğutulduktan sonra, primerler şablona bağlanır (tavlama denir) ve polimerazın başlaması için bir yer yaratır.
PCR Tekniği
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), termofillerin ve termofilik polimeraz enzimlerinin (yüksek sıcaklıklarda ısıtıldıktan sonra yapısal bütünlüğü ve işlevselliği koruyan enzimler) keşfedilmesiyle mümkün olmuştur.
PCR tekniğinde yer alan adımlar şöyledir:
- DNA şablonunun optimize edilmiş konsantrasyonları, polimeraz enzimi, primerler ve dNTP'ler ile bir karışım oluşturulur. Enzimi denatüre etmeden karışımın ısıtılması kabiliyeti, DNA numunesinin çift sarmalının, 94 santigrat derecedeki sıcaklıklarda denatüre edilmesine izin verir.
- Denatürasyonun ardından, numune, primerler için tek iplikli DNA şablonlarına bağlanmayı (bağlanma) kolaylaştıran, daha da orta bir aralıkta, yaklaşık 54 derece soğutulur.
- Döngünün üçüncü aşamasında, numune uzama için Taq DNA Polimeraz için ideal sıcaklık olan 72 dereceye ısıtılır. Uzama sırasında DNA polimeraz, her bir primerin 3 'uçlarına tamamlayıcı dNTP'ler eklemek ve ilgili genin bölgesinde çift iplikli DNA'nın bir bölümünü oluşturmak için bir şablon olarak orijinal tek DNA dizisini kullanır.
- Tam olarak eşleşmeyen DNA sekanslarına tavlanmış primerler 72 derecede tavlama yapılmaz, böylece ilgili genle uzama sınırlanır.
Bu denatüre etme, tavlama ve uzama işlemi çoklu (30-40) kez tekrarlanır, böylece karışımdaki istenen genin kopya sayısı katlanarak artar. Bu işlem elle yapıldığında oldukça zor olsa da, numuneler çoğu moleküler laboratuarda yaygın bir şekilde programlanabilir bir Thermocycler içinde hazırlanabilir ve inkübe edilebilir ve tam bir PCR reaksiyonu 3-4 saat içinde gerçekleştirilebilir.
Her denatüre etme basamağı, önceki döngünün uzama işlemini durdurur, böylece yeni DNA dizisini keser ve onu, istenen genin büyüklüğüne yaklaştırır.
Uzama döngüsünün süresi, ilgilenilen genin büyüklüğüne bağlı olarak daha uzun veya daha kısa yapılabilir, ancak sonuç olarak, tekrarlanan PCR döngüleri ile, şablonların çoğunluğu, ilgilenilen genin büyüklüğü ile sınırlı olacaktır. her iki primerin ürünlerinden üretilecektir.
Sonuçları geliştirmek için manipüle edilebilir başarılı PCR için birkaç farklı faktör vardır. PCR ürününün varlığını test etmek için en yaygın kullanılan yöntem agaroz jel elektroforezidir . DNA parçalarını boyut ve yüke göre ayırmak için kullanılır. Parçalar daha sonra boyalar veya radyoizotoplar kullanılarak görselleştirilir.
Evrim
PCR'nin keşfinden beri, orijinal Taq dışındaki DNA polimerazlar keşfedilmiştir. Bunlardan bazıları daha iyi “düzeltici” yeteneğe sahiptir veya daha yüksek sıcaklıklarda daha stabildir, böylece PCR'nin özgüllüğünü geliştirir ve yanlış dNTP'nin yerleştirilmesinden kaynaklanan hataları azaltır.
Bazı PCR uygulamaları, spesifik uygulamalar için tasarlanmıştır ve şimdi moleküler genetik laboratuarlarında düzenli olarak kullanılmaktadır. Bunlardan bazıları Real-Time PCR ve Reverse-Transcriptase PCR'dır. PCR'nin keşfi aynı zamanda DNA dizilemesi, DNA parmak izi ve diğer moleküler tekniklerin geliştirilmesine de yol açmıştır.