DNA dizilimi aynı zamanda, bir baz çifti kadar küçük boyutlara sahip DNA ipliklerini ayırmak için jel elektroforezini kullanma yeteneğimize de bağlıdır.
DNA dizilimi
1970'lerin sonunda, daha uzun DNA molekülleri için iki DNA sıralama tekniği icat edildi. Bunlar Sanger (veya dideoksi) metodu ve Maxam-Gilbert (kimyasal bölünme) metoduydu . Maxam-Gilbert yöntemi, kimyasallar tarafından nükleotide özgü bölünmeye dayanır ve en çok oligonükleotidleri (genellikle kısa uzunluktaki 50 baz çiftinden daha küçük olan kısa nükleotid polimerler) dizmek için kullanılır. Sanger yöntemi daha sık kullanılır çünkü teknik olarak uygulanması daha kolay kanıtlanmıştır ve tekniğin PCR ve otomasyonunun gelişiyle, tüm genler dahil olmak üzere DNA'nın uzun ipliklerine kolaylıkla uygulanır. Bu teknik, PCR uzama reaksiyonları sırasında dideoksinükleotitler tarafından zincir sonlandırılmasına dayanmaktadır.
Sanger Yöntemi
Sanger yönteminde, analiz edilecek DNA dizisi bir şablon olarak kullanılır ve primerler kullanılarak serbest şeritlerin üretilmesi için bir PCR reaksiyonunda DNA polimerazı kullanılır.
Dört farklı PCR reaksiyon karışımı hazırlanır, bunların her biri, dört nükleotitten (ATP, CTP, GTP veya TTP) birine belirli bir oranda dideoksinükleosit trifosfat (ddNTP) analogu içerir. Yeni DNA zincirinin sentezi, bu analoglardan biri ekleninceye kadar devam eder, bu sırada iplikçik, prematüre bir şekilde kesilir.
Her bir PCR reaksiyonu, hepsi de, bu reaksiyon için dideoksi etiketli olan nükleotid ile biten, farklı uzunluklarda DNA ipliklerinin bir karışımını içerecektir. Jel elektroforezi daha sonra dört reaksiyonun şeritlerini dört ayrı şerit halinde ayırmak ve hangi iplik uzunluklarının nükleotid ile sona erdiğini temel alarak orijinal şablonun dizisini belirlemek için kullanılır.
Otomatik Sanger reaksiyonunda, dört farklı renkli floresan etiketi ile etiketlenmiş primerler kullanılır. Farklı dideoksi nükleotidlerinin varlığında PCR reaksiyonları, yukarıda tarif edildiği gibi gerçekleştirilir. Bununla birlikte, daha sonra, dört reaksiyon karışımı daha sonra birleştirilir ve bir jelin tek bir şeridine uygulanır. Her bir parçanın rengi, bir lazer ışını kullanılarak saptanır ve bilgi, her bir rengin zirvelerini gösteren kromatogram üreten bir bilgisayar tarafından toplanır, bu şablondan, şablon DNA sekansı belirlenebilir.
Tipik olarak, otomatik sıralama metodu sadece uzunluk olarak yaklaşık 700-800 baz çiftine kadar olan sekanslar için doğrudur. Bununla birlikte, Primer Yürüyüş ve Shotgun dizileme gibi adım adım yöntemlerin kullanılmasıyla daha büyük genlerin tam dizilerini ve aslında tüm genomları elde etmek mümkündür.
Primer Walking'de , daha büyük bir genin uygulanabilir bir kısmı Sanger yöntemi kullanılarak dizilir. Yeni primerler, sekansın güvenilir bir segmentinden üretilir ve orijinal reaksiyonların menzili dışında kalan genin sekansının sekanslanması için kullanılır.
Av tüfeği dizilimi , ilgili DNA parçasını, daha uygun (yönetilebilir) boyutlu parçalara rastgele kesmek, her parçayı dizilemek ve parçaları örtüşen dizilere göre düzenlemek zorundadır. Bu teknik, üst üste binen parçaları düzenlemek için bilgisayar yazılımı uygulaması ile daha kolay hale getirilmiştir.